(一)原理：氨基酸具有酸、碱两重性质，由于氨基酸含有-COOH基显现酸性，又含有-NH2基显现碱性。由于这二个基的相互作用，使氨基酸成为中性的内盐。当参加甲醛溶液时，-NH2与甲醛结合，其碱性消失，损坏内盐的存在，就可用碱来滴定-COOH基，以直接办法测定氨基酸的量，反应式或许以下面三种方式存在。

　　(1)40％中性甲醛溶液，以麝香草酚酞为指示剂，用1NNaOH溶液中和。

　　称取一定量样品(约含20毫克左右的氨基酸)于烧杯中(如为固体加水50毫升)，加2-3滴指示剂，用0.1OONNaOH溶液滴定至淡蓝色。参加中性甲醛20毫升，摇匀，静置1分钟，此刻蓝色应消失。再用0.1OONNaOH溶液滴定至淡蓝色。记载两次滴定所耗费的碱液毫升数，用下述公式核算

　　与单色法相同，只是在此法中运用了两种指示剂。从剖析成果看，双指示剂甲醛滴定法与亚硝酸氮气容量法(此法操作杂乱，不作介绍)附近单色滴定法稍偏低，首要由于单指示剂甲醛滴定法是以氨基酸溶液PH值作为麝香草酚酞的结尾。PH值在9.2，而双指示剂是以氨基酸溶液的PH值作为中性红的结尾，PH值为7.0，从理论核算看，双色滴定法较为精确。

　　取相同的两份样品，别离注入100毫升三角烧瓶中，一份参加中性红指示剂2-3滴，用0.100NNaOH溶液滴定结尾(由红变琥珀色)，记载用量，另一份参加麝香草酚酞3滴和中性甲醛20毫升，摇匀，以0.100NNaOH准溶液滴定至淡蓝色。按下述公式核算。

　　将试样中有机物损坏，钙变成溶于水的离子，用草酸铵定量沉积，用高锰酸钾法直接测定钙含量。

　　称取高锰酸钾（GB643）约1.6g，溶于1000mL蒸 馏水中煮沸10min，冷却且静置1～2d，用烧结玻璃滤器过滤，保存于棕色瓶中。

　　称取草酸钠（GB1289基准物，105℃枯燥2h，存于枯燥器中）0.1g，精确至0.0002g，溶于50mL水中，再加硫酸溶液（3.2）10mL，将此溶液加热至75～85℃，用制造好的高锰酸钾（3.5）滴定,溶液出现粉赤色且1min不褪色为结尾,滴定结束时,溶液温度在60℃以上, 一起作空白试验。

　　与1.00mL高锰酸钾规范溶液〔c（1／5KMnO4）＝1.000mol／L〕适当的以克表明的草酸钠质量。

　　取具有代表性试样，损坏至40目，用四分法 缩分至200g，装于密封容器，避免试样成分改变或蜕变。

　　称取试样2～5g于坩埚（4.5）中，精确至0.0002g，在电炉上当心炭化，再放入高温炉（4.4）于550℃下灼烧3h（或测定粗灰分后接连进行），在盛灰坩埚中参加盐酸溶液（3.1）10mL和浓硝酸数滴,当心煮沸,将此溶液转入容量瓶（4.6）,冷却至室温,用蒸馏水稀释至刻度,摇匀,为试样分化液。

　　称取试样2～5g于凯氏烧瓶（4.12）中，精确至0.0002g，参加硝酸（GB623剖析纯）10mL，加热煮沸，至二氧化氮黄烟逸尽，冷却后参加70％～72％高氯酸（GB623剖析纯）10mL,当心煮消沸至溶液无色,不得蒸干（风险1）,冷却后加蒸馏水50mL,且煮欢腾驱赶二氧化氮,冷却后转入容量瓶（4.6）,用蒸馏水稀释至刻度,摇匀,为试样分化液。

　　精确移取试样液10～20mL（含钙量20mg左右）于烧杯（4.11）中，加蒸馏水100mL，甲基红指示剂（3.6）2滴，滴加氨水溶液（3.3）至溶液呈橙色，再加盐酸溶液（3.1）使溶液洽变赤色（pH2.5～3.0）,当心煮沸,渐渐滴加草酸铵溶液（3.4）10mL,且不断拌和,如溶液变橙色,应补滴盐酸滴溶液至赤色,煮沸数分钟,放置过夜使沉积陈化（或在水浴上加热2h）。

　　将沉积和滤纸转入原烧杯，加硫酸溶液（3.2）10mL，蒸馏水50mL，加热至75～80℃，用0.05mol／L高锰酸钾溶液滴定，溶液呈粉赤色且半分钟不褪色为结尾。

　　与1.00mL高锰酸钾规范溶液 〔c（1/5KMnO4）＝1.000mol／L〕适当的以克表明的钙的质量。

　　含钙量在5％以上，答应相对偏差3％； 含钙量5％～1％时，答应相对偏差5％；含钙量1％以下，答应相对偏差10％。

　　A2  每种滤纸的空白值不同，耗费高锰酸钾溶液体积也不同，因而至少每盒滤纸作一次空白溶液测定。

　　将试样中有机物损坏，使钙溶解制备成溶液，用三乙醇胺、乙二胺、盐酸羟胺和淀粉溶液消搅扰离子的影响，在碱性溶液中以钙黄绿素为指示剂，用EDTA标溶液络合滴定钙，可快速测定钙的含量。

　　B3.6 淀粉溶液，10g／L 称取1g可溶性淀粉入200mL烧杯中，加5mL水潮湿。加95mL沸水搅匀，煮沸，冷却备用（现配现用）。

　　B3.8 钙黄绿素甲基百里香酚蓝指示剂0.1g钙黄绿素与0.13g甲基百里香酚蓝、5g氯化钾研细混匀，储存于磨口瓶中备用。

　　称取2.497g于105～110℃枯燥至恒重的基准碳酸钙，溶于40mL盐酸（B3.2）中，加热赶除二氧化碳，冷却，用水搬运移至1000mL容量升中，稀释至刻度。

　　B3.10 乙二胺四乙酸二钠规范滴定溶液称取3.8gEDTA入200mL烧杯中，加200mL水，加热溶解冷却后转至1000mL容量瓶中，用水稀释至刻度。

　　精确移取试样分化液5～25mL（含钙量2～25mg）。加水50mL，加淀粉溶 液（B3.6）10mL、三乙醇胺（B3.4）2mL、乙二胺（B3.5）1mL、1滴孔雀石绿（B3.7），滴加氢氧化钾溶液（B3.3）至无色, 再过量10mL,加0.1g盐酸羟胺（B3.1）（每加一种试剂都须摇匀）,加钙黄绿素（B3.8）少量,在黑色布景下立即用EDTA规范滴定溶液 （B3.10）滴定至绿色荧光消失出现紫赤色为滴定结尾。

　　1 本规范规则了饲猜中钙的测定办法本规范适用于合作饲料， 单一饲料和浓缩饲料 2 将试样中有机物损坏， 使钙溶解制备成溶液， 用三乙醇胺， 乙二胺， 盐酸羟胺和淀粉溶液消除搅扰离子的影响， 在碱性溶液中以钙黄绿素为指示剂， 用 EDTA 规范溶液络合滴定钙，可快速测定钙的含量 3 本附录中所用试剂除特别的条件处， 均为剖析纯， 水为蒸馏水或同纯度水。 3. 1 盐酸羟铵 3. 2 盐酸1 +3（V1 +V2） 3. 3 氢氧化钾溶液200 克/L 3. 4 三乙醇胺水溶液1 +1 3. 5 乙二胺水溶液（1 +1 ） 3. 6 淀粉溶液， 1 0 克/L， 称取1 克可溶性淀粉入200ml 烧杯中， 加 5ml 水潮湿， 加 95ml 沸水搅匀， 煮沸冷却备用（现用现配） 3. 7 孔雀石绿水溶液 3. 8 钙黄绿素甲基百里香酚蓝指示剂， 0。 1 g 钙黄绿素与 0。 1 3g 甲基百里香酚蓝， 5g 氯化钾研细混匀， 储存于磨口瓶中备用 3. 9 钙规范溶液0。 001 0g/ml，称取2。 497g 于1 05~11 0℃枯燥至恒重的基准碳酸钙， 溶于40 ml 盐酸中， 加热赶除二氧化碳， 冷却， 用水搬运至1 000 ml 容量瓶中， 稀释至刻度。 3. 1 0 乙二胺四乙酸二钠规范滴定溶液称取3。 8gEDTA 入200ml 烧杯中加 200ml 水， 加热溶解冷却后转至1 000ml 容量瓶中， 用水稀释到刻度。 3. 1 0. 1 EDTA规范滴定溶液的标定。精确汲取钙规范溶液1 0ml 按试样测定法进行测定 3. 1 0. 2 EDTA滴定溶液对钙的滴定度按式核算: T=C×V/ V1—V0 式中： T—EDTA规范溶液对钙的滴定度g/ml c—钙规范溶液的浓度g/ml v—所取钙规范溶液的体积， ml v1—EDTA规范滴定溶液的用量,ml V0—滴定空白时的 EDTA规范滴定溶液的用量,ml 4 4. 1 实验室用样品损坏机或研钵 4. 2 分样筛孔径0。 45mm（40 目） 4. 3 剖析天秤感量0。 0001 g 4. 4 高温炉电加热， 可控温度在550±20℃ 4. 5 坩埚瓷质 4. 6 容量瓶1 00 ml 4. 7 滴定管酸式25 或50 ml。 4. 8 玻璃漏斗6cm直径 4. 9 定量滤纸中速， 7~9cm。 4. 1 0 移液管1 0， 20ml 4. 11 凯氏烧瓶250 或500ml。 5 取有代表性样品， 损坏至 40 目， 用四分法缩分至 200 g， 装于密封容器， 避免试样成分改变或蜕变。 5.1 称取2~5 g 样品于坩埚中精确至0。 0002 g， 在电炉上当心炭化， 再放入高温炉于550℃下灼烧3 小时， （或测定粗灰份后接连进行） 在盛灰坩埚中参加盐酸溶液1 0ml 和浓硝酸数滴，当心煮沸， 将此溶液转入容量瓶中冷却至室温， 用蒸馏水稀释到刻度， 摇匀为试样分化液 6 精确移取试样分化液5~25ml（含钙量5~25mg） 加水50ml， 加淀粉溶液1 0ml， 三乙醇胺2 ml， 乙二胺1 ml， 1 滴孔雀石绿， 滴加氢氧化钾溶液至无色再过量1 0ml， 加 0。 1 g 盐酸羟胺每加一种试剂都必须摇匀， 加钙黄绿素用许， 在黑色布景下立即用 EDTA 规范溶液滴定到绿色荧光消失出现出紫赤色为滴定结尾。 7 Ca%=T×V2×V0×1 00/(m×v1 ) 式中 T——EDTA规范溶液对钙的滴定度g/ml V0—试样分化液的总体积， ml V1 —分取试样分化液的体积ml V2—实践耗费EDTA规范滴定溶液的体积ml m—试样的质量g 所得成果应表明至二位小数 8 每个试样取两个平行样进行测定。 以其算术平均值为成果含钙量在5%以上， 答应相对偏差3%， 含钙量5%~1 %时， 答应相对偏差5%， 含钙量1 %以下答应相对偏差1 0%。

　　下列规范所包括的条文，经过在本规范中引证而构成为本规范的条文。本规范出书时，所示版别均为有用。一切规范都会被修订，运用本规范的各方应讨论运用下列规范最新版别的或许性。

　　将试样中的有机物损坏，使磷元素游离出来，在酸性溶液中，用钒钼酸铵处理，生成黄色［(NH4)3PO4NH4VO3•16MoO3］络合物，在波长420nm下进行比色测定。

　　实验室用水应契合GB/T 6682中三级水的规范，本规范中所用试剂，除特别阐明外，均为剖析纯。

　　A.49.4钒钼酸铵显色剂：称取偏钒酸铵1.25g，加水200mL加热溶解，冷却后再参加250mL硝酸，另称取钼酸铵25g，加水400mL加热溶解，在冷却的条件下，将两种溶液混合，用水定容1000mL。避光保存，若生成沉积，则不能持续运用。

　　g/mL的磷规范液。A.49.5磷规范液：将磷酸二氢钾在105℃枯燥1h，在枯燥器中冷却后称取0.2195g溶解于水， 定量转入1000mL容量瓶中，加硝酸3mL，用水稀释至刻度，摇匀，即为50

　　取有代表性试样2kg，用四分法将试样缩分至200g，损坏过0.42mm孔筛，装入样品瓶中，密封保存备用。

　　A.52.1.1干法（不适用于含磷酸氢钙［Ca（H2PO4）2］的饲料）

　　称取试样2g～5g（精确至0.002g）于坩埚中，在电炉上当心炭化，再放入高温炉，在550℃灼烧3h（或测粗灰分后接着来进行），取出冷却，参加10mL盐酸溶液和硝酸数滴，当心煮沸约10min，冷却后转入100mL容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，为试样分化液。

　　称取试样0.5g～5g（精确至0.0002g）于凯氏烧瓶中，参加硝酸30mL，当心加热煮沸至黄烟逸尽，稍冷，参加高氯酸10mL，持续加热至高氯酸冒白烟（不得蒸干），溶液根本无色，冷却，加水30mL，加热煮沸，冷却后，用水搬运至100mL容量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，为试样分化液。

　　称取试样0.2 g～1g（精确至0.0002g）于100mL烧杯中。慢慢参加盐酸10ｍL，使其悉数溶解，冷却后转入100mL容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，为试样分化液。

　　精确移取磷规范溶液0.0、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0mL于50mL容量瓶中，各加钒钼酸铵显色剂10mL，用水稀释至刻度，摇匀，常温下放置10min以上，以0.0mL溶液为参比，用1cm比色皿，在420nm波长下，用分光光度计测定各溶液的吸光度。以磷含量为横坐标，吸光度为纵坐标，制作作业曲线mL容量瓶中，参加钒钼酸铵显色剂10mL，用水稀释至刻度，摇匀，常温下放置10min以上，用1cm比色皿在420nm波长下测定试样分化液的吸光度，在作业曲线上查得试样分化液的含磷量。g～750精确移取试样分化液1.0mL～10.0mL（含磷量50

　　每个试样称取两个平行样进行测定，以其算术平均值为测定成果。所得的成果应表明至小数点后两位。